Þróun glerhersluaðferða

Glerherslun var ekki ein uppfinning. Hún varð til þegar vísindamenn leystu röð ólíkra vandamála sem tengdust frumum, fósturvísum, líffærum og að lokum lífvarðveislu mannfólks.

Markmiðið virðist einfalt: að kæla vatnsríkan vef í glerástand án þess að skaðlegur ís myndist.

Framkvæmdin er ekki einföld. Kælivarnarefni geta verið eitruð. Flutningur þeirra inn í frumur getur raskað jafnvægi frumnanna. Stór sýni kólna misjafnt, byggja upp álag og eru mun erfiðari að hita upp aftur.

Nútímaaðferðir eru þess vegna heildarkerfi, ekki uppskriftir. Árangur þeirra ræðst af samspili efnafræði, blóðflæðis, hitastigs, tímasetningar, lögunar og mælinga.

Áður en glerherslun kom til: kuldinn olli öðrum skaða

Elstu aðferðir lífvarðveislu byggðust að mestu á frystingu. Kæling hægði á efnaferlum, en vatnið kristallaðist í ís.

Við ísmyndun safnast salt og önnur uppleyst efni í þann vökva sem eftir verður. Frumur geta því orðið fyrir vélrænum skemmdum, mjög háum styrk uppleystra efna, vatnstapi og skemmdum á frumuhimnum, allt samtímis.

Hraðari kæling getur gert kristalla smærri, en venjulegt vatn krefst ótrúlega hraðrar kælingar til að ná glerástandi án efnahjálpar. Það er aðeins mögulegt í mjög þunnum sýnum.

Söguleg vandamál sneru ekki bara að því að ná niður lágu hitastigi. Þau sneru að því að kæla vatnið án þess að það myndaði skaðlega ískristalla.

1937 til 1938: fyrstu tilraunirnar með hraðabundna glerherslu

Basile Luyet setti fram glerherslu sem lífvarðveisluleið árið 1937.

Árið 1938 greindu Luyet og Eugene Hodapp frá því að hreyfigeta hefði náðst aftur í froskasáðfrumum eftir að þær voru þurrkaðar með þéttum súkrósa og útsettar fyrir vökvalofti.

Upprunalega tilraunin byggði á örsmáum filmum og gríðarlega hraðri kælingu. Hún sýndi fram á eðlisfræðilegan möguleika, en ekki aðferð sem hægt væri að yfirfæra á líffæri.

Þessi leið er nú kölluð glerherslun með hraðri kælingu: kælt er svo hratt að ís nær hvorki að myndast né vaxa.

Þegar sýnin stækka verður þessi aðferð óframkvæmanleg. Yfirborðsflatarmál vex hægar en rúmmál, þannig að miðja stórs sýnis getur ekki fylgt yfirborðinu nógu hratt.

1949: glýserín breytir vandamálinu

Christopher Polge, Audrey Smith og Alan Parkes komust að því árið 1949 að glýserín gæti varið sáðfrumur við lágt hitastig.

Grein þeirra í Nature sýndi fram á mikilvægi efna sem komast inn í frumur og vernda þær gegn frystiskemmdum.

Þessar sameindir komast inn í frumur, binda vatn og draga úr því hve mikill ís myndast við ákveðið hitastig. Þær geta einnig dregið úr skaðlegri samþjöppun uppleystra efna meðan á frystingu stendur.

Uppgötvunin breytti frystilíffræðinni, því kælihraði var ekki lengur eina breytan sem skipti máli. Efnasamsetning gat breytt því hvernig vatn hagar sér við fasabreytingar.

Hún leiddi einnig til nýs vandamáls sem þurfti að leysa. Meira af kælivarnarefni bælir ísmyndun betur, en eykur á sama tíma efnafræðilegan og osmótískan skaða.

1959 til 1968: fleiri efni og þrepaskipt gjöf

Árið 1959 greindu James Lovelock og Marcus Bishop frá því að dímetýlsúlfoxíð verndaði nokkrar frumugerðir gegn frystiskaða.

DMSO komst auðveldar í gegnum ákveðnar frumuhimnur en glýserín. Það útvíkkaði þann hóp frumna sem hægt var að verja með kælivarnarefnum og er enn mikið notað, bæði á rannsóknarstofum og í klínískri lífvarðveislu.

John Farrant rannsakaði síðan hvort unnt væri að auka styrk kælivarnarefnis samhliða lækkandi hitastigi, þannig að vefurinn héldist í ofurkældu vökvaástandi án ísmyndunar.

Þetta var undanfari eins af grunnþáttum nútímaaðferða: að auka styrk kælivarnarefna í þrepum við lágt hitastig, í stað þess að setja vef strax í lausn í fullum styrk.

Þrepaskipt gjöf takmarkar osmótískt áfall. Lægra hitastig hægir á fjölmörgum efnahvörfum og getur gert útsetningu, sem annars væri skaðleg, viðráðanlegri.

Árið 1968 sýndu tilraunir að hægt væri að kæla rauð blóðkorn niður að hitastigi fljótandi köfnunarefnis án sýnilegrar ísmyndunar, ef styrkur glýseríns var nægilega hár.

Hugmyndafræðilegu byggingarsteinarnir voru til staðar. Það sem skorti var raunhæf leið til að beita þeim á flókinn vef með æðakerfi.

1984: glerherslun verður aðferð til að varðveita líffæri

Greinin frá 1984, „Vitrification as an Approach to Cryopreservation“, setti glerherslun fram á nýjan hátt sem raunhæfa leið til að varðveita líffæri til framtíðarnota.

Aðferðin var oft kölluð glerherslun við jafnvægi. Í stað ómögulega hraðrar kælingar var styrkur kælivarnarefna aukinn nægilega mikið til að unnt væri að ná nauðsynlegum kælihraða í stærra kerfi.

Þessi nýja nálgun afhjúpaði þrjár samtengdar takmarkanir:

• Lausnin þarf að koma í veg fyrir ísmyndun við kæli- og upphitunarhraða sem raunhæft er að ná.
• Líffærið þarf að þola gjöf og fjarlægingu þeirrar lausnar.
• Kælivarnarefnið þarf að berast til allra hluta líffærisins áður en kæling hefst.

Efnablanda getur virkað vel í tilraunaglasi en brugðist í líffæri, vegna þess að viðnám í æðum, dreifingarleiðir og eiturvirkni geta ráðið úrslitum.

1985: fósturvísar lifa af varðveislu í glerástandi

William Rall og Gregory Fahy greindu frá íslausri lífvarðveislu músafósturvísa við −196 °C árið 1985.

Þetta var afgerandi líffræðileg sönnun. Fósturvísar spendýra gátu lifað af kælingu og uppþíðingu eftir að hafa verið varðveittir í glerástandi.

Fósturvísar eru enn örsmáir. Hitastig og styrkur í þeim getur breyst hratt og jafnt, í samanburði við líffæri fullvaxins einstaklings.

Niðurstaðan studdi aðferðina, en undirstrikaði jafnframt vandann sem fylgir stærri sýnum.

Stærðarvandamálið kvíslast í fjögur vandamál

1. Eiturvirkni kælivarnarefna

Styrkurinn sem þarf til glerherslu getur skaðað prótín, frumuhimnur og efnaskipti frumna. Eiturvirkni ræðst af efninu, styrk þess, hitastigi, útsetningartíma og vefjagerð.

Þetta þýðir að „minni eiturvirkni“ er ekki aðeins eiginleiki tiltekins efnis. Hún ræðst af öllu ferlinu, bæði gjöf efnisins og fjarlægingu þess.

2. Osmótískt álag

Þegar þéttri lausn er bætt við dregst vatn úr frumunum. Þegar lausnin er fjarlægð getur vatn streymt of hratt inn í frumurnar á ný.

Nútímaaðferðir beita stigvaxandi styrk, burðarlausnum, hitastýringu og efnum sem komast ekki inn í frumur til að halda rúmmálsbreytingum frumna innan viðráðanlegra marka.

3. Ójöfn dreifing

Líffæri er ekki ílát með einsleitum vökva. Kælivarnarefni berast um æðarnar, fara yfir háræðaveggi og dreifast síðan um vefinn.

Blóðtappar, bjúgur, æðasjúkdómar, blóðþurrð og blóðheilaþröskuldurinn geta valdið því að styrkur á einstökum svæðum verði of lágur til að hindra ísmyndun.

Þess vegna er við blóðflæðisaðgerðir fylgst með þrýstingi, flæði, hitastigi og styrk kælivarnarefnis í bláæðafrárennsli, í stað þess að reiða sig eingöngu á rúmmál lausnarinnar.

4. Hitastigshallar

Stór hlutur kólnar utan frá og inn. Mismunandi hitastig valda mismunandi samdráttarhraða.

Nálægt glerbreytingarhitastigi og við lægra hitastig getur efnið ekki jafnað innri spennu nægilega hratt. Fari spennan yfir styrk efnisins geta sprungur myndast.

Lausnin fólst í stýrðum kælihraða, hitajöfnun nærri Tg (glerbreytingarhitastigi) og hægari kælingu í gegnum glerbreytingarsviðið. Þessi grunnatriði liggja nú til grundvallar tölvustýrðri kælingu við lífvarðveislu manna.

1990 til 2000: blöndur taka við af einfaldri einsefnahugsun

Ekkert einstakt kælivarnarefni hámarkaði allar kröfur. Vísindamenn fóru í auknum mæli að blanda saman efnum sem komast inn í frumur, þannig að styrkur hvers efnis gæti verið lægri en þegar það er notað eitt og sér.

Burðarlausnir stýrðu jónum, sýrustigi og osmótískum aðstæðum. Fjölliður sem komast ekki inn í frumur gátu haft áhrif á vatnsjafnvægi í vefjum og ástand æða.

Tilbúin ísheftandi efni voru notuð til að hamla misleitri ísmyndun og ísvexti. Þau minnkuðu þörfina á að reiða sig eingöngu á háan styrk kælivarnarefna.

Lausnir eins og VS55 og síðar M22 voru dæmi um kerfishönnun: þar voru mörg efni og ísheftandi efni sameinuð vandlega samsettri burðarlausn, auk skilgreindra aðferða við blóðflæði og hitastýringu.

Yfirlitsgrein um glerherslu líffæra frá 2004 fjallar um framfarir við að draga úr eiturvirkni og kalskaða, stýra ísmyndun og bæta blóðflæði í líffærum.

Mikilvægu framfarirnar fólust ekki í því að eiturvirknin hyrfi. Vísindamenn lærðu að draga úr álaginu með samspili efnasamsetningar, tíma og hitastigs.

Tilraunir með nýru kanína: mikilvægar en auðvelt að oftúlka

Tilraunir með nýru kanína sýndu að hægt væri að dæla flóknum glerherslulausnum um æðakerfi spendýralíffæris, kæla það í glerástand, hita það aftur upp og græða það í líkama.

Eitt ígrætt nýra starfaði sem eina nýra kanínu í lengri tíma.

Niðurstaðan skiptir máli vegna þess að hún sýndi að unnt var að fara frá örsmáum sýnum yfir í starfandi líffæri. Hún staðfesti ekki áreiðanlega klíníska aðferð.

Síðari fræðigreinar benda á að langtímaárangur ígræðslu náðist ekki með endurtakanlegum hætti. Dreifing efnisins, eiturvirkni og hefðbundin yfirborðshitun héldu áfram að vera takmarkandi þættir.

Þannig ber að túlka niðurstöðurnar: þær eru mikilvæg sönnun á meginreglu, en vandamál við endurtakanleika og yfirfærslu á stærri líffæri eru enn óleyst.

2015: gæði varðveislu verða sýnileg á smágerð taugamóta

Við aldehýðstöðgaða lífvarðveislu voru efnafræðileg festing, gjöf kælivarnarefna og glerherslun sameinaðar í heila kanína og svína.

Rannsóknin frá 2015 greindi frá skýrum frumuhimnum, taugamótum, blöðrum, mýelíni og innanfrumubyggingum eftir uppþíðingu og undirbúning fyrir rafeindasmásjárskoðun.

Hún sýndi fram á að afar vel varðveitt smágerð taugavefjar gæti haldist eftir íslausa varðveislumeðferð á stórum heilum.

Hún sýndi ekki fram á lífvænlega endurlífgun. Aldehýðfesting stöðgar líffræðilegan vef með varanlegum hætti og er ósamrýmanleg endurheimt lifandi starfsemi.

Tilraunin svaraði því spurningu um varðveislu byggingar, en ekki spurningunni um endurlífgun í heild.

Mikilvægasta aðferðafræðilega framlag hennar var að gæði varðveislu skuli metin með beinni skoðun á þeim byggingum sem varðveita á, en ekki aðeins eftir því hvort sýni virðist vera í glerástandi.

2023: nanóagnahitun leysir vandamál við endurhitun nýra í rottum

Kæling er aðeins annar hluti þess sem þarf til afturkræfrar lífvarðveislu. Endurhitun er oft erfiðari.

Sé upphitunin of hæg getur ís myndast þegar efnið fer úr glerástandi. Berist hiti að mestu utan frá, geta hitastigshallar valdið sprungum í líffærinu.

Nanóagnahitun getur tekið á báðum vandamálunum með því að dreifa járnoxíðnanóögnum um æðakerfið og hita þær með segulsviði á útvarpstíðni.

Árið 2023 glerherstu vísindamenn nýru í rottum, geymdu þau í allt að 100 daga, hitu þau upp með nanótækni og græddu þau í líkamann.

Nýrun héldu uppi lífsnauðsynlegri nýrnastarfsemi hjá viðtökudýrum sem höfðu ekki eigin nýru þann eftirfylgnitíma sem greint var frá.

Árangurinn byggði á meira en uppþíðingunni. Hópurinn tók upp minna eitraða efnablöndu og bætti aðferð við gjöf kælivarnarefna til að ná betri styrk þeirra í vefjum.

Þetta er endurtekið stef í sögu glerherslunar: lausn eins vandamáls leiðir oft í ljós næsta vandamál, og árangursrík endurheimt krefst þess að hvert skref ferlisins gangi upp.

2024 til 2026: stærri eðlisfræðileg kerfi og starfhæfur taugavefur

Árið 2024 greindu vísindamenn frá eðlisfræðilegri glerherslu í stærð sem samsvarar mannlegu líffæri í kerfum sem samsvara mannlegu líffæri að stærð og rúma 0,5 til 3 lítra.

Þeir sameinuðu innri hitamælingar, hitajöfnun, stýrða kælingu og skoðun með smásneiðmyndatækni. Þeir sýndu einnig fram á nanótæknihitun í rúmmáli upp að 2 lítrum.

Stærstu tilraunirnar voru fyrst og fremst eðlisfræðilegar. Það er nauðsynlegt að forðast sýnilegan ís og sprungur, en það staðfestir ekki líffræðilega endurheimt líffæris á stærð við mannslíffæri.

Árið 2026 greindi rannsókn í PNAS frá skammtímaendurheimt starfrænnar virkni í heilavef fullvaxinna músa eftir glerherslu og uppþíðingu.

Í rannsókninni voru metin heilindi vefjarins, svörun hvatbera, örvanleiki taugafrumna, boðflutningur um taugamót og langtímastyrking.

Rannsóknin náði til heilaþynna úr músum og smárra undirbúningssýna úr heilavef, en ekki mannsheila. Þýðing hennar er þrengri en enn veruleg.

Hún sýndi að taugavefur fullvaxinna spendýra getur endurheimt raflífeðlisfræðilega starfsemi eftir varðveislu í glerástandi.

Lífvarðveisla manna byggir á sömu vísindum, undir erfiðari aðstæðum

Tilraunir með varðveislu líffæra til framtíðarnota byggjast á heilbrigðum vefjum, stýrðri tímasetningu og fyrirfram skipulögðum aðgangi að æðakerfinu.

Lífvarðveisla manna hefst eftir að lögformlegt andlát hefur verið staðfest. Sjúkdómur, hlýtt blóðþurrðartímabil, blóðtappar, bjúgur, flutningur og æðasjúkdómar geta öll skaðað gjöf kælivarnarefna.

Nánasta markmiðið er að varðveita byggingu vefja með hugsanlega viðgerð í framtíðinni í huga, en ekki að gera ferlið afturkræft nú þegar.

Þess vegna má ekki yfirfæra niðurstöður úr rannsóknarstofu beint á sjúklinga.

Hvernig Tomorrow.bio lagaði glerherslun að aðstæðum úti á vettvangi

Tomorrow.bio færði meðferð með kælivarnarefnum fyrir allan líkamann yfir í sérútbúna sjúkrabíla. Meðferðin getur hafist nærri sjúklingnum í stað þess að bíða eftir flutningi til Sviss.

Þetta breytir mikilvægum þætti sem efnafræði getur ekki bætt upp: hversu langt blóðþurrðartímabil verður áður en gjöf kælivarnarefna hefst.

Núgildandi aðferð byggist á VM-1 lausn sem hefur verið aðlöguð að gjöf kælivarnarefna á vettvangi og flutningi á þurrís að henni lokinni.

Rannsóknaráætlun EBF hefur prófað VM-1 undir hermdum aðstæðum eftir andlát, þar á meðal að loknu þriggja klukkustunda löngu heitu blóðþurrðartímabili.

Í áætluninni voru mældir ljósbrotstuðull í bláæðafrárennsli, tímalengd gjafar, þyngdarbreyting, samdráttur heilans og ísmyndun, samhliða prófunum á breyttri gjafarlausn og breyttri aðferð.

Þar liggur helsta áskorunin í mannlegum tilfellum: ekki í því hvort fullkomin lausn geti myndað gler, heldur í því hversu vel sjúklingur með blóðþurrð þolir gjöf kælivarnarefna og hversu vel hún berst um vefina.

Mæling varð hluti af aðgerðinni

Fyrri rannsóknir á glerherslu staðfestu árangur oft með gagnsæi, hitamælingum (kalorímetríu), röntgengreiningu, lifun eða starfsemi eftir uppþíðingu.

Við lífvarðveislu manna er enn sem komið er ekki unnt að nota endurlífgun sem lokaviðmið matsins. Þess vegna þarf að styðjast við óífarandi mælingar og rannsóknir á sýnum til að meta gæði varðveislunnar.

Tomorrow.bio tekur sneiðmyndir af hverjum sjúklingi við hitastig fljótandi köfnunarefnis til að meta dreifingu kælivarnarefna og greina ís eða stórsæja galla með stöðluðum hætti.

Með sérstöku samþykki má nota örsýni úr taugavef til mats með rafeindasmásjá á frumuhimnum, taugamótum og staðbundinni smágerð vefjabyggingar.

Þessum aðferðum og takmörkunum þeirra er lýst í gæðaeftirlitsferlum lífvarðveislu.

Mælingar breyta sjálfu þróunarferlinu. Þegar mistök og bilanir verða sýnileg og hægt er að bera þau saman milli tilfella er unnt að bregðast markvisst við með breytingum á efnafræði og aðferðum.

Hvað hefur batnað og hvað er enn óleyst

Með nútímaglerherslun hefur tekist að ná ýmsu sem eldri frystiaðferðir gátu ekki:

• Íslausri varðveislu margra frumna, fósturvísa og smávefja.
• Starfhæfri endurheimt glerherstra dýralíffæra í afmörkuðum tilraunum.
• Byggingarvarðveislu á smágerð taugamóta í föstum heilum spendýra.
• Tölvustýrðri kælingu og hitajöfnun stærri kerfa.
• Rúmmálsuppþíðingu með tækni eins og nanótæknihitun.
• Sneiðmynda og rafeindasmásjáraðferðum til að meta raunverulegan árangur varðveislu.

Ekki hefur tekist að ná fram afturkræfri lífvarðveislu á heilum mannslíkama.

Óleyst vandamál eru meðal annars blóðþurrð eftir andlát, ójöfn gjöf kælivarnarefna, eiturvirkni þeirra, áhrif blóðheilaþröskuldar, hitastigshallar um allan líkamann, forvarnir gegn sprungum og öruggri, jafnri uppþíðingu.

Jafnvel þótt bygging vefja varðveittist vel væru enn óleyst vandamál varðandi viðgerð, endurlífgun og meðferð þeirrar dánarorsakar sem upphaflega leiddi til andláts.

Fjallað er nánar um þennan mun í umfjöllun um tæknilegar áskoranir við afturkræfa lífvarðveislu.

Frekari lestur

• Stutt saga kuldavarðveislu
• Hvernig kælivarnarefni virka
• Eðlisfræðilegar og líffræðilegar hliðar glerherslu nýra
• Glerherslun og nanótæknihitun nýra sem grædd voru í rottur
• Eðlisfræðileg glerherslun og nanótæknihitun í stærð sem samsvarar mannlegu líffæri